PCR分類(相關信息)

PCR:即聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction),利用DNA 在體外95°C時解旋(

),55°C時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合(退火),再調溫度至72°C左右, DNA

聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈(延伸)

PCR儀實際就是一個溫控設備,能在95'C, 55°C, 72°C之間很好地進行溫度控制。根

DNA擴增的目的和檢測的標準可以將PCR儀分為:普通PCR儀,梯度PCR儀,原位PCR

儀,實時熒光定量PCR儀等幾類。

普通PCR:

-般把一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀,稱之為普通PCR儀,也就是傳統的PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運行。

普通PCR儀主要應用于科研、教學、臨床醫學、檢驗、檢疫等。

梯度PCR:

PCR反應能否成功,退火溫度是關鍵,梯度PCR儀每個孔的溫度可以在指定范圍內按照梯度設置,根據結果,-步就可以摸索出最適反應條件。-次性PCR擴增可以設置-系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱之為梯度PCR儀。

不同的DNA片段其最適合的退火溫度不同,通過設置-系列的梯度退火溫度進行擴增,從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的最適合退火溫度進行有效的擴增。

梯度PCR儀主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增,這樣既節約時間,也節約成本。在不設置梯度的情況下亦可當做普通的PCR用。

梯度PCR儀多應用于分子生物學、醫學、食品工業、司法科學、生物技術、環境科學、微生物學、臨床診斷、流行病學、遺傳學、基因芯片、基因檢測、基因克隆、基因表達等領域以聚合酶鏈式反應( Picymerase Chain Reaction,PCR為特征的、以檢測DNA/RNA為目的的各種病原體檢測及基因分析。

原位PCR

PCR是提取細胞或組織中的DNA進行基因擴增反應,而原位PCR是保持細胞或組織的完整性,使PCR反應體系滲透到組織和細胞中,在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增。

不但可以檢測到靶DNA,而且還可以了解靶DNA存在于何種細胞中,更有利于探討靶DNA與細胞之間的關系。

原位PCR儀主要應用于:(1)檢測外源性基因片段,提高檢出率,集中在病毒感染的檢查上,如HIV、HPV、HBV、CMV等;(2)觀察病原體在體內分布規律;(3)內源性基因片段,如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、IgmRNA片段、癌基因片段等;(4)檢測導入基因;(5)遺傳病基因檢測如β-地中海貧血。 

實時熒光定量PCR:

在普通PCR儀設計基礎.上增加熒光信號采集系統和計算機分析處理系統,形成了具有熒光定量功能的PCR儀器。其PCR擴增原理和普通PCR擴增原理相同,在PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記,使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號采集系統實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統,得出量化的實時結果輸出。

熒光定量PCR儀有單通道,雙通道和多通道之分。當只用-種熒光探針標記的時候,選用單通道;有多種熒光標記的時候使用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記和目的基因表達產物,因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量,需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR,實現一次檢測多種目的基因的功能。

熒光定量PCR儀主要應用于臨床醫學檢測、生物醫藥研發、食品行業、科研院校等。熒光定量檢測技術在臨床診斷方面很多,主要集中在各種病原體引起疾病的臨床診斷,如肝炎類疾病、性病、與優生優育相關的疾病以及肺結核等等。

 

通道: channel指的是針對每一種熒光的檢測器,比如你在-一個管中做多個顏色,針對多個靶基因。每個顏色需要-個檢測器來檢測熒光信號的強弱,每一個針對不同顏色的檢測器,就是一個通道。在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時,為了確保實驗結果的精確性和準確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料,ROX是作為內參的,即參照和校正實驗結果。在ABI的機器里顯示為紅色的水平線。如果你的擴增線在剛開始的時候就高于ROX證明有基因組DNA污染。)或專用的Referencedye,這些熒光染料都必須單獨使用-個檢測通道。這樣以來,真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個,而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自己廠家的專用的熒光染料或試劑開放的,有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。

 

選擇單通道實驗還是多通道實驗?

這是要根據實驗需要來選擇的,如果有一個、兩個或是三個基因要進行比較,并用看家基因進行對照,可以考慮選擇多通道實驗。多通道實驗的好處是可以消除樣本加樣的誤差。但要克服的困難也比較多,一是條件的優化比較麻煩, 即多種PCR反應以及探針要在同一個反應條件下進行,并且效率都要比較,高,另一個困難是要求相互之間沒有干擾,因為干擾會影響到實驗結果。還有一一個困難是當一個基因的模板數顯著大于其他基因時,因為共用核音酸等資源的原因,會讓模板數少的基因的定量值變小或變為零。因此一般兩通道的實驗比較多些,即一個基因進行多樣本比較,用看家基因進行對照。

硬件設計:傳統的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大,而且無需特殊的耗材。有些傳統的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發、CCD檢測,這些光學結構在96孔板的頂部,每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同一-邊緣效應,對結果產生影響。為了保證精確、準確的實驗結果,這類儀器在實驗過程中通常會使用ROX (-種熒光染料)或專用的Reference dye作為參照校正實驗結果。鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經成為很多用戶頭痛的問題。在實驗過程中鹵鎢燈作為一種熱光源,產生較多熱能對實驗結果有一定的影響。CCD最大的優點就是可以同時掃描所有樣品中的熒光信號,但是靈敏度較低,而且同時檢測樣品間的熒光信號存在干擾。像ABI、Bio-rad 公司生產的熒光定量PCR就屬于這一種。

 

創新的離心式的儀器通常選用LED激發、PMT檢測,離心式的設計上避免了邊緣效應。LED光源是冷光源對實驗沒有影響,因此無需采用其他熒光染料校正儀器,而且使用壽命長無需經常更換。PMT每次只能收集.單個熒光信號,但是檢測靈敏度高。但這類儀器運行速度非???,但也存在樣本量小、耗材昂貴、沒有梯度功能、存在時間積分等缺點。Corbett Rotor-gene系列和RocheLightcycler 系列均為這一.類儀器。

在熒光定量PCR儀的眾多技術參數中,升降溫速度也是廠家喜歡大力宣傳的指標。更快的升降溫,可以縮短反應進行的時間,而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時間,提高PCR的特異性。

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