小羅開講 | 數字PCR之“分”而治之微孔反應體積的穩定性及準確性對dPCR定量結果的影響

轉自羅氏診斷生命科學公眾號
 



大家好,本堂課我們繼續分析“分”而治之,談談微反應體積的穩定性及準確性對dPCR定量結果的影響。


 
dPCR檢測反應體系中模板的拷貝數濃度是根據以下公式計算【1】:

Tc=−ln (1 − p)/Vp

Tc:反應體系中模板分子的拷貝數濃度(copy/µL)

p:陽性納米微孔的比例,Vp是微反應的體積【2】。
如圖1所示,當微反應體積存在差異,而這種差異又被忽略的情況下,p值會偏低,導致dPCR的結果也偏低,尤其在整個反應體積中模板濃度比較高的情況下,影響更大;反之當原反應體系中模板濃度足夠低,或者有足夠的微反應數量能 每個納米孔的單分子占有率,微反應體積偏差可以被忽略【3】。由此得知,微反應體積是影響dPCR檢測結果準確性的又一重要因素。

圖1 納米微孔體積變化對分區間樣品分布的影響示意圖

(來源:羅氏診斷整理)



 
如何控制微反應的體積偏差,

 dPCR檢測結果的準確性?


 
首先要選擇更穩定的分區方式。


微反應的形成主要有以下兩種方式:微滴式dPCR(ddPCR)和芯片式dPCR(dPCR)。

微滴式dPCR是將兩種互不相溶的液體的其中一種作為連續相(油),另外一種作為分散相(水),在水/油兩相表面張力和剪切力共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續相中,從而生成液滴實現多單元獨 擴增。這種方式具有成本低,容易實現的優點,在早期推出的dPCR平臺上被廣泛應用。但這種方式的局限性就在于微滴的均一性以及微滴之間的相互干擾直接影響微反應單元的數量以及微滴體積的準確判斷,即使是同類型的微滴發生器之間形成的微滴體積也會存在明顯差異【4】【5】。如果在分析的過程默認微滴體積是個固定值,微滴式dPCR 定量結果與使用真實微滴體積計算的濃度之前有明顯差異【2】。



芯片式dPCR是通過芯片設計將納升液體封閉在高通量的微孔或微量通道中進行后續的PCR擴增及擴增后結果的熒光判讀。芯片式dPCR生成的反應微孔是物理分區,體積均一,具有較高的穩定性,體系之間影響較小, dPCR定量結果的準確性和穩定性。



但上述兩種分區方式不論哪一種,微孔反應體積的偏差都不容忽視【6】【7】,因為樣品的前處理方法、檢測反應的體系等因素都會引起微孔反應體積的差異。




因此, dPCR檢測結果的準確性的第二要素是監控及校準微反應體積。

納米微孔的體積是影響dPCR檢測結果的一個關鍵因素,選擇合適的微反應形成方式可以降低微反應體積的偏差。但無論選擇哪種方式,實現對微反應體積的監測及校準是 dPCR檢測結果準確性的重要因素。因此,dPCR平臺自帶微反應體積監測及校準功能,才能有效把控微反應體積對檢測結果的影響,從而 檢測的結果不受微孔體積偏差的影響。



dPCR技術優勢已不需要再贅述,面對目前市場上眾多的平臺選擇,如何去篩選適合自身應用的dPCR平臺是關鍵。


 


 




參考文獻:

1. Standardization of nucleic acid tests for clinical measurements of bacteria and viruses. J Clin Microbiol. 2015; 53: 2008–14.

2. Droplet volume variability as a critical factor for accuracy of absolute quantification using droplet digital PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry volume 409, 2017; 6689–6697

3. Considerations for Digital PCR as an Accurate Molecular Diagnostic Tool Clin Chem, Volume 61, Issue 1, 1 January 2015; 79–88.

4. DNA copy number concentration measured by digital and droplet digital quantitative PCR using certified reference materials. Anal Bioanal Chem. 2015; 407:1831–40.

5. Method for measuring the volume of nominally 100 μm diameter spherical water-in-oil emulsion droplets. NIST Spec Publ. 2016; 260-184.

6. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Anal Chem 2012; 84:1003–11.

7. Single molecule detection in nanofluidic digital array enables accurate measurement of DNA copy number. Anal Bioanal Chem 2009; 394:457– 67.

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